随着 CRISPR-Cas 等基因编辑技术的迅猛发展，精确、高效、安全地修改人类基因组成为实现个体化医疗、治疗遗传病与癌症等疾病的重要策略。然而，编辑工具的持续优化仍未完全突破效率与安全性瓶颈，尤其是在依赖同源定向修复（homology-directed repair，HDR）的序列插入、替换等操作中，效率偏低成为限制其临床转化的重要因素。
近日，中国医学科学院基础医学研究所和北京协和医学院刘德培团队近期在 Cell Press（细胞出版社）旗下期刊 Trends in Genetics 发表综述“Optimizing homology-directed repair for gene editing: the potential of single-stranded DNA donors”，系统回顾了 HDR 的分子机制、影响因素及优化策略，重点聚焦于单链 DNA 供体（single-stranded DNA donors，ssDNA）的功能特点与应用前景，提出 ssDNA 是提升 HDR 效率、推动基因编辑临床转化的潜在突破口。
HDR 基础与 ssDNA 供体介导修复
HDR 是一种高保真修复路径，依赖供体 DNA 作为模板，实现对双链 DNA 断裂（DSB）后的精准修复。根据供体形态的不同，HDR 可分为依赖双链供体（dsDNA）和单链供体（ssDNA）两种途径，后者又被称为单链模板修复（SSTR，single-stranded template repair）。
相较于 dsDNA，ssDNA 供体具备结构简单、免疫原性低、毒性小等优势，更适用于原代细胞、干细胞等难转染系统，且在不依赖病毒载体的递送条件下，仍能实现较高的编辑效率。其独特的生物兼容性，使其成为新一代基因治疗供体的重要候选。
HDR 效率的决定因素与提升策略
1. 细胞 DSB 修复途径选择
HDR 的发生受限于细胞周期，仅在 S/G2 期显著激活，而非同源末端连接（NHEJ）则在各周期均可执行，竞争性强且常主导修复结果。两种 DSB 修复途径分别由不同的蛋白因子所介导。因此，通过生物技术和小分子抑制剂（如 M3814、AZD7648）调控不同 DSB 修复途径的特异性因子，可显著抬高 HDR 占比，从而实现高效的精准基因编辑。
2. ssDNA 供体的可及性与稳定性
供体能否高效、稳定地到达特定的 DSB 位点参与 DNA 损伤修复，是影响 HDR 成功率的另一类关键因素。该综述系统总结了多种提升 ssDNA 供体介导 HDR 效率的方法：
供体结构优化：线性 ssDNA 供体同源臂的长度，编辑位点与切割位点的距离，避免二次切割的设计等因素都潜在影响着 HDR 的效率。近期开发出来的环状 ssDNA（cssDNA）策略也受到一定的关注，适用于构建大位点敲入模型，已在 iPSC 中已实现较高的敲入效率。
结合 Cas9 蛋白提高可及性：通过多种化学修饰系统，如生物素-链霉亲和素、SNAP 标签、S1mplex 系统等，将 ssDNA 连接到 Cas9 RNP，以提高 ssDNA 供体 DSB 位点的可及性从而提升基因编辑效率。
借助内源蛋白提高可及性：利用功能序列模块，如 RAD51 识别偏好序列连接到 ssDNA 供体的同源臂，可实现 DNA 损伤修复位点对 ssDNA 供体的精准招募。这类方法不依赖于任何化学修饰系统，结合 DSB 修复途径调控策略可实现 HDR 的效率可达 90.03%。
细胞内供体的稳定性：外源导入的 ssDNA 供体可能会被细胞内的各种核酸酶快速降解。一些化学修饰，如在 5'/3' 端引入磷硫键或 TEG 修饰，有助于防止供体降解，提高 HDR 效率。环状 ssDNA 可以有效避免核酸外切酶的降解作用，是其提高 HDR 效率的机制之一。
ssDNA 供体的多维应用：从基础研究到转化医学
1. 实验模型构建与功能筛选
结合 CRISPR 技术，ssDNA 供体可实现细胞与动物模型中高效构建点突变，尤其适用于饱和基因组编辑（saturation genome editing，SGE）及位点功能筛选。其高度的可控性为构建功能突变库和注释非编码区变异提供了理想平台，助力基因功能图谱绘制与致病突变筛查。
2. 细胞治疗中的基因编辑
在 CAR-T、CAR-NK、CAR-M 等免疫细胞工程中，利用长链 ssDNA（lssDNA）与环状 ssDNA（cssDNA）替代病毒载体，可实现效率高、脱靶率低的精准插入，同时降低插入突变与免疫风险。目前，部分平台在 GMP 条件下已建立稳定的 lssDNA 制备流程，适用于工业化细胞治疗产品开发。
此外，ssDNA 也广泛用于 iPSC 的突变修复与功能基因插入，其高保真的编辑特性为干细胞基因治疗提供了坚实基础，具备良好扩展性与临床应用潜力。
3. 在体基因治疗
随着 LNP 等非病毒递送系统的成熟，ssDNA 供体的在体应用逐步成为现实。在肺部、肝脏等器官中，利用 Cas9 mRNA/sgRNA 与 ssDNA 共同递送，已在动物模型中实现体外 HDR 效率达 56%、体内达 20% 的编辑效果。部分平台具备组织特异性，适用于多种遗传病如囊性纤维化、肺泡蛋白缺陷等的精准治疗。
总结与展望
作为一种兼具高保真修复能力与广泛适应性的编辑供体，ssDNA 正在重塑精确基因编辑的效率天花板。从分子设计到递送策略，ssDNA 供体的不断优化正推动其从实验室研究走向临床转化。
未来的发展方向包括：解析 SSTR 的分子机制；开发新型高效 ssDNA 供体；建立标准化、高通量的 ssDNA 生产平台；设计和优化 ssDNA 体内递送系统，实现靶向、安全的原位编辑。
ssDNA 介导的 HDR 有望在未来的合成生物学、再生医学与个体化治疗中发挥核心作用，成为连接基础研究与临床实践的重要桥梁。
